آلفا توکسین یا فسفولیپاز C  (PLC ) توسط باکتری کلستردیوم پرفژنس تولید می گردد و خواص کشنده درمونوکرتیک را دارا می باشد. تمامی سویه های کلستردیوم قادر به تولید این توکسین می باشند که در توسعه میونکروز کلستریدی نقش بسزایی را ایفا می کنند. آلفا توکسین باعث بروز علائم در انسان و دام می گردد و تأثیرات کشنده بر سیستم روده ای را نشان می دهد. در این تحقیق سعی بر آن خواهیم داشت که روش های متفاوت خالص سازی و استخراج آلفا توکسین کلستردیوم پرفژنس تیپ A را با هم مقایسه نماییم. روش اول شامل خالص سازی آلفا توکسین با استفاده از تکنیک های ترکیبی کروماتوگرافی شامل رسوب دهی سولفات آمونیوم، کروماتوگرافی تبادل یون با استفاده از DEAE- Sephadex در مقادیر 7 و 9 pH  و کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون با استفاده از Sephadex G-100 بود، روش دوم مبتنی بر استفاده از کروماتوگرافی افینیتی اجرا گردید. درجه خلوص توکسین آلفا در هر مرحله از فرآیند خالص سازی با استفاده از SDS-PAGE ارزیابی گردید .با بررسی نتایج حاصل از دو روش فوق نتایج زیر حاصل گردید. بازدهی روش اول 88 درصد و بازده روش دوم 7/91درصد بود. مقادیر فعالیت ویژه برای روش اول و دوم به ترتیب   U/mg 69170 و U/mg 71/105 محاسبه گردید. نتایج  نشان داد که از روش کروماتوگرافی افینیتی می توان برای خالص سازی آلفا توکسین تولیدشده از کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ A با خلوص بالا و نسبت فعالیت به مقدار پروتئین (HU/mg) 108700 استفاده گردد.

در این پژوهش از روش PCR-ELISA برای تشخیص حساس و اختصاصی کلستریدیوم بوتولنیوم تیپ A استفاده و قسمت کد کننده بخش فعال (کاتالیتیک) سم بوتولیسم به وسیله PCR تکثیر شد. سپس محصول PCR به وسیله DIG-ELISA آشکار گردید. حساسیت این روش کمتر از pg 0.5 DNA کروموزومی بود. در کنار آن حساسیت روش PCR نیز مطالعه شد که حساسیت آن DNA 0.5 pg کروموزومی بود. از سوی دیگر شناسایی این باکتری در نمونه های غذایی که به طور مصنوعی آلوده شده بودند نیز صورت گرفت و میزان حساسیت به دست آمده تلقیح 100 باکتری به ازای هر میلی لیتر بعد از 18 ساعت انکوباسیون تحت شرایط بی هوازی بود. در ضمن آزمایشهایی برای بررسی ویژگی و تکرارپذیری روش به کار برده شده انجام گرفت که نتایج حاصل بیانگر عدم واکنش متقاطع این روش با تیپهای B و E این باکتری و نیز تکرار پذیر بودن آزمایشها بود.

مقدمه: باکتری کلستریدیوم بوتولینوم قادر به تولید اسپور بوده و می تواند با تولید سم کشنده باعث بیماری فلج شل و یا بوتولیسم شود. تشخیص بوتولیسم با یافتن سم و یا باکتری در نمونه غذای مشکوک امکان پذیر است. روش استاندارد برای یافتن سم استفاده از حیوان آزمایشگاهی می باشد. این روش بسیار حساس و اختصاصی ولی پر هزینه، زمان بر و پر زحمت بوده، نیاز به استفاده از حیوان آزمایشگاهی دارد و تنها تعداد معدودی از نمونه ها را می توان در یک زمان مورد بررسی قرار داد. روش های دیگری از جمله استفاده از آنتی بادی ها در سیستم تشخیص الیزا جهت تشخیص توکسین به کار رفته ولی با توجه به وجود واکنش متقاطع بین تیپ های این باکتری کمتر مورد توجه قرار گرفته است. در این تحقیق برای شناسایی تیپ های A، B و E کلستریدیوم بوتولینوم که در انسان ایجاد بیماری می کنند، از روش Multiplex PCR استفاده شد. مواد و روش کار: تایید اولیه تیپ های باکتریایی کلستریدیوم بوتولینوم مورد استفاده در این تحقیق با روش بیوشیمیایی و نیز Bioassay صورت گرفت. جهت شناسایی بوسیله PCR، سه جفت پرایمر با دمای ذوب نزدیک به هم طراحی گردید. هر پرایمر به طور اختصاصی برای ژن سم بوتولینیوم تیپ های A، B و E عمل نموده و این سه جفت پرایمر قادر بود به طور هم زمان سه سروتیپ را شناسایی نماید. نتایج: بزرگی محصول PCR تیپ های ,A B و E به ترتیب782، 205 و 389 جفت باز بود که با روش هضم آنزیمی نیز صحت محصول PCR تایید شد. باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس به عنوان کنترل منفی مورد استفاده قرار گرفت و نتایج PCR آن با پرایمرهای طراحی شده منفی بود. بحث: این روش سریع، حساس و دقیق بوده و از آن در جهت شناسایی سه تیپ بیماریزای انسانی باکتری کلستریدیوم بوتولینوم می توان استفاده نمود.

در اسفند ماه سال 1398، سه رأس بره 5 تا 15 روزه نژاد مخلوط به بیمارستان دامپزشکی دانشگاه تهران ارجاع داده شدند. شکایت دامدار از وجود تلفات 20 درصدی (42 رأس) در بره­, های 4 تا 17 روزه گله خود که تنها با شیر مادر تغذیه می­, شدند، بود. در مشاهده و معاینه بالینی، زمین­, گیری، افسردگی، ضعف، دمای 40 درجه سلسیوس، اتساع شیردان با مایعات، تاکی­, پنه، تاکیکاردی و پرخونی مخاطات ثبت گردید. بره­, ها پس از معاینات بالینی، تحت بررسی­,خو­, ن­, شناسی قرارگرفته و سپس در شرایط بهداشتی کالبدگشایی شدند. همچنین خون، مغز استخوان، مغز، ریه، قلب، کبد، کلیه، روده و شیردان مورد کشت­, های باکتریایی هوازی و بی­, هوازی قرار گرفتند. در بررسی خون­, شناسی، آنمی نرموسیتیک نرموکرومیک، لکوپنی، لنفوپنی، انحراف به چپ، حضور شیستوسیت، کراتوسیت، میلوسیت و متامیلوسیت مشاهده شد. در کالبدگشایی، زخم­, های سرسنجاقی در مخاط شیردان، حضور توده­, های خونی شبیه به دانه قهوه در محتویات شیردان و رنگ­, پریدگی کلیه­, ها وجود داشت. در رنگ­, آمیزی گرم گسترش مستقیم شیردان، تعداد زیادی باکتری میله­, ای شکل گرم مثبت مشاهده شد. همچنین از شیردان و روده دام­, های بیمار، کلستریدیوم پرفرینجنس تیپA و اشریشیا کولای غیرپاتوژن جدا گردید. مطالعه حاضر نشان داد که باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس تیپA ممکن است در بیماری­,التهاب ­, شیردان بره­, ها دخیل باشد.

ماکارونی از جمله فرآورده های غذایی مورد علاقه اکثر خانواده ها بوده و بازار مصرف آن در اکثر نقاط جهان در حال گسترش است، بنابراین سالم بودن آن از لحاظ میکروبی و کیفیت بالای پخت آن، مهم ترین عامل برای مصرف کننده می باشد. از لحاظ سالم بودن محصول از نظر میکروبی، مواد اولیه مورداستفاده باید دارای شرایط مناسب باشند. در بررسی حاضر از 5 کارخانه تولیدی ماکارونی در منطقه جاجرود- رودهن 160 نمونه آب، آرد و ماکارونی به منظور تعیین آلودگی های میکروبی به ویژه آلودگی به کلستریدیوم پرفونژنس گرفته شد. آلودگی آب از لحاظ کلستریدیوم پرفرنژنس شامل 8 نمونه (5 درصد)، آلودگی آرد 3 نمونه (1.87 درصد ) ودرمورد ماکارونی شامل 10 نمونه (6.25 درصد) بود با توجه به نتایج بدست آمده می توانیم آلودگی ماکارونی به کلستریدیوم پرفرژنس را به میزان 85 درصد به آب و 15 درصد به آرد نسبت دهیم. همچنین کاهش شمارش کلی میکروب از 11.87 درصد در مورد آرد به 1.25 درصددر ماکارونی، و کپک از 9.37 درصد در آرد به 0.62 درصد در ماکارونی، نشان می دهد که با رعایت شرایط مناسب در تولید نه تنها ریزسازواره ها افزایش نمی یابند، بلکه کاهش شدید در میزان آنها دیده می شود.

پژوهش حاضر با مدل سازی فیزیکی دو شکل از پروفیل تاج سرریز کلید پیانویی استاندارد (تیپA) و تاج زیگزاگی در 5/2 سیکل انجام شد. الگوی زیگزاگ با 9 تکرار از سینوس کامل به دامنه ارتفاع 1 سانتی متر در طول تاج جانبی طراحی گردید. عمق نسبی بحرانی جریان روی تاج سرریز مطابق با محدوده تغییرات دبی عبوری در بازه (2 1/0) و بستر رسوبی با دو دانه بندی غیرچسبنده (67/6 و 13/2 =) انتخاب گردید. همچنین؛ برای انجام تحلیل ابعادی از روش پای-باکینگهام استفاده شد. نتایج نشان داد که حداکثر عمق گودال آبشستگی با کلیدپیانویی شدن سرریز لبه تیز خطی به طور تقریبی 31 درصد کاهش یافته است. با زیگزاگی شدن تاج جانبی سرریز کلیدپیانویی استاندارد (تیپA)، نشان داده شد که طول گودال آبشستگی با افزایش 15 درصدی و عمق تعادل آبشستگی با کاهش 12 درصدی نسبت به مدل شاهد رخ داده است. علاوه بر این؛ در مقادیر حداکثر عمق نسبی بحرانی hc/P و تراز پای آب hd/P نسبت به مقادیر حداقلی، مقدار حداکثر عمق آبشستگی به ترتیب 73 درصد افزایش و 90 درصد کاهش می یابد. همچنین، مشاهده شد که مقادیر آبشستگی در رسوبات ریزدانه 68 درصد بیشتر از رسوبات درشت-دانه رخ داده است. روند انتقال رسوب در گودال و پشته رسوبی با افزایش عدد فرود ذره، افزایشی است. در بازه عدد فرود ذره 7/2-1/2= Frd50 برای سرریزهای کلید پیانویی به طور متوسط مقادیر عمق و طول گودال آبشستگی با 10 درصد کاهش و 22 درصد افزایش برآورد شده است.

تکنولوژی DNA نوترکیب یک تکنیک مولکولی in vitro جهت جداسازی و دستکاری قطعات DNA می باشد. با استفاده از این تکنیک ساخت مولکول های کایمریک به نام مولکول DNA نوترکیب، سپس واردکردن این مولکول نوترکیب به سلول های زنده، همانندسازی و تکثیر آنها در سلول امکان پذیر شد. امروزه تکنولوژی فیوژن پروتئین یک استراتژی برای دسترسی سریع، ارزان و پربازده بیان پروتئین هاست. توالی نوکلئوتیدی ژن اپسیلون کلستریدیوم پرفرینجنز تیپ (etxD) D و ژن آلفای کلستریدیوم سپتیکوم (csa) از GenBank به دست آمد. سپس جهت تولید فیوژن پروتئین کایمریک، فیوژن ژن اپسیلون- آلفا طراحی گردید. ساختارهای دوم وسوم و ویژگی های فیوژن پروتئین حاصل به وسیله نرم افزارهای آنلاین تعیین شد.نتایج نشان داد ساختار فیوژن ژن طراحی شده برای بیان فیوژن پروتئین کایمریک مناسب است.

اهداف: توکسین بوتولینوم به عنوان قوی ترین توکسین شناخته می شود. این توکسین علاوه بر کاربردهای درمانی در پزشکی (بوتاکس)، تهدیدی در جنگ های زیستی و بیوتروریسم است. تهیه آنتی بادی علیه توکسین کلستریدیوم بوتولینوم تیپ A تا G علاوه بر کاربرد در شناسایی جدایه های کلستریدیوم بوتولینوم توکسیژنیک، در درمان مسمومیت ناشی از این توکسین نیز نقش دارد. هدف از این مطالعه، تولید آنتی توکسین کلستریدیوم بوتولینوم تیپ E بود.روش ها: برای ایمن سازی حیوانات آزمایشگاهی (مرغ، موش و خرگوش)، ابتدا توکسویید با ادجوانت کامل فروند به شکل زیرجلدی یا داخل ماهیچه ای تزریق و در یادآور اول تا سوم، توکسویید با ادجوانت ناقص فروند تزریق شد. در فواصل و پایان تزریقات، خون گیری به عمل آمد و تیتر آنتی بادی تولیدشده با استفاده از روش الایزا اندازه گیری شد.یافته ها: پس از تزریق هر یادآور، افزایش قابل ملاحظه ای در تیتر آنتی بادی سرم حیوانات آزمایشگاهی دیده شد. تیتر آنتی بادی توکسین کلستریدیوم بوتولینوم تیپ E در سرم مرغ، خرگوش و موش به بیش از 1:3200 افزایش یافت. پس از تخلیص آنتی بادی، مقدار کمتر از 0.156 میکروگرم آنتی بادی تخلیص شده موشی و مقدار کمتر از 0.312 میکروگرم آنتی بادی تخلیص شده خرگوشی قادر به شناسایی توکسین بود.نتیجه گیری: پس از تزریق توکسویید، آنتی بادی در بدن حیوان آزمایشگاهی افزایش می یابد. تولید آنتی توکسین اختصاصی برای تشخیص بوتولیزم، بر اساس واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی و همچنین برای درمان مسمومیت ضروری است.

نوروتوکسین های بوتولینوم، سمی ترین ترکیبات بیولوژیک شناخته شده اند که باعث ایجاد فلج عضلانی می شوند. خاصیت آنزیمی این توکسین ها، مهار آزاد سازی میانجی عصبی استیل کولین را باعث می شود. مطالعه حاضر با هدف تولید نوترکیب بخش کاتالیتیک (زنجیره سبک) سم بوتولینوم تیپ A با درصد خلوص بالا، به منظور ارزیابی فعالیت آنزیمی انجام شد. توالی ژن زنجیره کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ A از پایگاه ژنی NCBI گرفته شد. پس از بهینه سازی کدون ترجیحی ژن مورد نظر برای E. coli، توالی نهایی ژن به منظور سنتز در وکتور بیانی pET28a(+) سفارش داده شد. پس از انتقال وکتور بیانی نوترکیب دارای ژن مذکور به میزبان E. coli BL21-DE3، فرایند بیان در شرایط استاندارد انجام شد. در ادامه تولید پروتئین مورد نظر به شکل محلول با بهینه سازی کشت میزبان و بیان پروتئین صورت پذیرفت. پروتئین بیانی به وسیله ستون Ni-NTA تخلیصو با آنتی بادی اختصاصی مورد تایید قرار گرفت. در این تحقیق بالاترین میزان بیان به شکل محلول، در شرایط غلظت 5/0 میلی مولار IPTG، با جذب نوری 5/0 و زمان القای 18 ساعت در دمای 18 درجه سانتی گراد به دست آمد. آزمایش های وسترن بلات و الایزا، وجود پروتئین هدف را تایید کردند. براساس نتایج، زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ A به شکل محلول تولید شد. فرایند تخلیص نیز با رزین تمایلی با کیفیت عالی انجام شد به طوری که پروتئین مورد نظر با درصد خلوص 98 به دست آمد.

مقدمه: گسترش روزافزون کاربردهای پزشکی توکسین تیپ A کلستریدیوم بوتولینوم، ضرورت دست یابی به روش های تولید و حفظ فعالیت بیولوژیک آن را اجتناب ناپذیر کرده است. لذا هدف این تحقیق، تولید و ابقای فعالیت توکسین تیپ A کلستریدیوم بوتولینوم می باشد.روش کار: در این تحقیق، کشت 24 ساله کلستریدیوم بوتولینوم تیپ A را به محیط کشت غنی شده تریپتی کیز سوی براث تلقیح و در خلال گرم خانه گذاری تولید توکسین بررسی و تعیین شد. با افزودن اسید سولفوریک به کشت 96 ساعته آن را اسیدی نموده و با سانتریفوژ رسوب حاصل جمع آوری گردید. سپس توکسین موجود در آن به صورت کریستالیزه درآورده شد. در جریان عمل، وجود توکسین با استفاده از تزریق به موش سوری تایید گردید.یافته ها: کلستریدیوم بوتولینوم در شرایط ذکر شده، در این آزمایش رشد نموده و توکسین تولید نموده، به طوری که 96 ساعت گرم خانه گذاری حداکثر مقدار توکسین تولید گردید. توکسین تولید شده در محدوده 4pH الی 5.8 به صورت کریستال های مکعب مستطیلی شکل تبدیل شد. پایداری توکسین کریستالیزه شده در طول زمان بررسی و تعیین گردید و مشخص شد که نگهداری توکسین کریستالیزه شده در یخچال 4 تا 6 درجه سانتی گراد، پس از 4 سال فعالیت بیولوژیک خود را حفظ کرده است.نتیجه گیری: توکسین تیپ A کلستریدیوم بوتولینوم در محیط آزمایشگاه به سرعت غیر فعال می گردد. بنابراین، حفظ فعالیت بیولوژیک آن برای مدت طولانی از اهمیت زیادی برخوردار است. چنانچه نتایج این تحقیق نشان داد، فعالیت بیولوژیک این توکسین در حالت کریستالیزه برای مدت طولانی پایدار باقی می ماند. بنابراین، استفاده از این امر هم برای پیشگیری از بوتولیسم و هم کاربردهای تحقیقاتی امکان پذیر می گردد.